今天探索吧就给我们广大朋友来聊聊血清学诊断的方法,以下关于观点希望能帮助到您找到想要的答案。
病毒感染的血清学诊断方法
优质回答常用的血清学方法有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等传统的方法，以及应用免疫学标记技术发展的酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫试验（RIA）及免疫荧光试验（IF）等特异、灵敏的微量血清学方法。
1.中和试验（NT）是指病毒在活体内或细胞培养中，被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。它既可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究其抗原结构。中和抗体特异性高、持续时间较长，因此流行病学调查也常用此指征。
2.血凝抑制试验许多病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称为血凝现象。这种现象能被相应抗体所抑制，称血凝抑制试验。其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的血凝素与红细胞的结合。
3.酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫试验（RIA）及免疫荧光试验（IF）参见第八节细菌感染的血清学诊断方法的介绍。
4.蛋白印迹试验（Westernblot，WB）用于检测HIV抗体，是HIV感染的确认试验。应用WB也可检测病毒抗原，但一般不常用。
5.检测病毒核酸的分子生物学试验检测患者血清等标本或病毒培养物中病毒基因或核酸片段的技术有多种：①病毒核酸扩增试验即聚合酶链反应（PCR）；②核酸杂交技术，包括点杂交、原位杂交、DNA-DNA印迹杂交（Southernblot）及RNA-DNA印迹杂交（Northernblot）等；③基因芯片技术（genechip）；④病毒基因测序等。目前，分子生物学技术日益广泛地应用于对病毒及其感染的检测和研究中。
血清学诊断 分子生物学诊断 什么叫
优质回答常规血清学诊断技术
1.1血清凝集抑制试验(HI)
因为许多动物病毒能够凝集某种类动物的红细胞,由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体与病毒结合后,血凝素即不能吸附于红细胞表面的受体上。HI不象其它血清学试验,不需要种属特异的结合〔1,2〕,因此特异性不好。一般检测快速,用于大量筛选野生或饲养的动物样品中的抗体。
1.2 补体结合试验(CF)
由于一个抗体分子与抗原结合后,可以导致数百个补体分子的激活,呈现一定的放大作用,所以补体结合试验是一个比较敏感的方法。虽然在某些病毒型的鉴定上,补体结合试验的检测能力有时不及中和试验和血凝抑制试验,但补体结合试验稳定,特异性高,重复性好,一直仍用于动物血清学中特异性抗体的定量检测〔3〕。
1.3 免疫荧光抗体技术
通过显微镜标本的免疫荧光染色而显示其结果,由于病毒抗原的标记比较困难,常用标记抗体检查未知抗原,此技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术的快速性,并可以在细胞水平上进行抗原定位,故在病毒学研究和诊断中都是一种应用很广的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可检测海洋微生物,尤其是细菌〔8〕,避免了细菌培养,从而提供了特异、快速的检测方法。
1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA是应用最广的一项免疫学诊断技术,以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上,随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验,无论是病毒病、禽传染性支气管炎抗体检测〔9〕、禽多瘤病毒特异性抗体检测〔10〕,还是细菌,例如牛布鲁氏杆菌病〔11,12〕,或是寄生虫引起的疾病、犬弓形体病〔13〕、羊肝片吸虫〔14〕,都应用到了酶联免疫吸附试验技术。因此,ELISA在各种动物疾病诊断上发挥了重要的作用。ELISA作为根除控制计划的初筛方法是非常理想的,费用相对较少,比常用的血清学方法有明显的优点,不需要抗体的第二特征,例如血凝性、结合补体的能力〔11〕,用时少,敏感性、重复性、特异性好,可筛选检测大量的样品〔15〕。利用纯化的抗原,单克隆抗体可提高反应检测的特异性〔9,10,11〕。
1.5 斑点酶联免疫吸附试验
将酶标反应板换成硝酸纤维膜,即为斑点酶联免疫吸附试验,将少量的试剂点在硝酸纤维膜或其它能结合蛋白的膜上,同抗原特异的抗体以及酶结合抗体反应,加入能形成不溶性有色沉淀的底物,使固相膜染色,形成有颜色的斑点,直接判读结果。利什曼原虫病〔16〕,牛呼吸道合包体病毒〔17〕,无钩绦虫〔18〕,免疫寄生虫〔19〕,克服了显微镜检查的麻烦。因硝酸纤维素膜吸附性能强,一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条,并在同一张膜条上点有多种抗原,将整个膜条与同一份血清反应,则可同时获得对多种疾病的诊断结果,3种主要禽类疾病的同时检测〔20〕,多种蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已广泛应用于动物疾病的诊断。
免疫血清学技术的发展趋向一直是高度特异性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,试验电脑化,反应微量化,方法标准化和试剂商品化,以及方法简便、快速。随着生物化学和分子生物学等学科迅速发展,相继出现了许多新的诊断技术,可以从分子水平对疾病的致病机理,诊断、治疗和预防进行研究。
2与分子生物学技术相结合的诊断技术
2.1PCR-ELISA
将PCR技术与ELISA相结合的一种抗原检测技术,又称免疫PCR。该技术是由Sano T等在1992年建立的,其本质是一种以PCR技术代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进ELISA,利用ELISA技术检测PCR扩增的产物〔3〕。利用了PCR的指数扩增效率带来极高的敏感度,同时又具有高的特异性的抗原检测系统。用亲和素包被微孔板,封闭后,加入标记于捕获探针3’端的生物素,而捕获探针5’端和待检靶序列5’端的一段互补,通过生物素和亲和素的交联作用,将捕获探针固定在微孔板上,制成固相捕获系统。其次PCR缓冲液中加入一定比例的地高辛标记的DUTP,经PCR扩增后,扩增产物与微孔板上的捕获探针进行液相杂交,带有地高辛的靶序列即被捕获,再在微孔板中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体,再加入底物如TMB显色,进行ELISA检测。
此法具有高灵敏度,检测结果可靠,可以进行半定量检测的优点,可用于病毒的检测、疾病诊断和目的基因检测。此方法较常规PCR灵敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鉴定PCR产物更快速,判定结果客观,易于操作,尤其在筛选大量品时,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常规PCR中,由于非特异的产物和不名原因引起的条带反应,而作出的主观解释〔23〕。可筛选大量食源性病原体,帮助加工厂监测食品的污染水平,进行危险品分析〔24〕。尤其在寄生虫检测方面,以前多用血涂片,而现在应用PCR-ELISA检测牛巴
临床上常用的血清学检查方法有哪几种？
优质回答主要有沉淀试验、凝集试验、补体结合试验、中和试验及与标记抗体有关的试验。
（1）凝集试验
包括玻板凝集法、全血平板凝集法、试管凝集法和琼脂扩散法。
①全血平板凝集反应
此法常用于传染性鼻炎、鸡白痢、鸡伤寒、鸡慢性呼吸道病等禽病的检疫和监测。
②琼脂扩散反应
当适当比例的抗原抗体在含有电解质的琼脂网状基质中自由扩散相遇时，形成肉眼可见的白色沉淀线。此法常用于鸡传染性法氏囊病、鸡马立克氏病、禽流感、禽脑脊髓炎、禽腺病毒感染等病的诊断，还常用于抗体监测和血清学流行病学调查。
（2）血凝与血凝抑制试验
试验原理：某些病毒能够与人或动物的红细胞发生凝集，称为血凝反应（HA）。这种凝集反应可被加入的特异性血清所抑制，称为红细胞凝集抑制试验，即血凝抑制反应（HI）。
此方法常用于鸡新城疫、禽流感、鸡产蛋下降综合征等病毒的诊断和血清学监测。
病毒的血清学技术有什么作用？
优质回答这是检测病毒的有效办法。血清学诊断和鉴定病毒的方法很多，常见的有ELISA（酶联免疫吸附法）、免疫电镜、琼脂双扩散、免疫电泳等。其中，ELISA（酶联免疫吸附法）为世界公认的植物病毒检测方法。应用抗血清鉴定植物病毒的亲缘关系，检测花卉的种子、鳞球茎和苗木中传带的病毒，是植物病毒检疫和检测上常用的快速鉴定和检验技术，经常和生物学、电镜技术等配合使用。
血清学反应的原理是人或高等动物对于侵入自身的有些异体物质产生免疫反应，即异体物质刺激淋巴组织产生相应的球蛋白称为抗体，能刺激机体产生抗体的异物称为抗原，抗原与其相对应抗体可以在机体内或机体外进行特异性反应，这种反应可以被用来预防疾病（人或动物）、鉴定和检测病原物。
抗原的分子具有许多化学活性基团，称为抗原决定簇，它们的一定结构决定了抗原的特异性。一般来说，抗原决定簇数目愈多，抗原性就愈强。植物病毒是核蛋白，外壳由许多亚基组成，抗原决定簇位于亚基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外壳，尤其是外壳的表面起着抗原的作用；单链核酸虽不能作为抗原，但它与外壳蛋白同时存在时，能增强外壳在动物体内的免疫反应；一般来说，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更强的抗原性。
抗体是动物机体受到抗原刺激后，由动物机体的免疫活性细胞产生的免疫球蛋白，通常以“Ig”来表示。在抗体中至少含有5种免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，约占70%～90%。IgG为易弯曲的Y形分子。由4条多肽链（2条重链和2条轻链）借4个2硫链连接组成。链的一端为氨基端，另一端为羧基端，酶可以降解IgG成为断片。常用木瓜酶和胃酶。前者将IgG降解成Fab和Fc两种片段；后者降解为F（ab）2和FC两种片段。Fab片段有抗体活性，1个Fab与1个抗原分子结合；F（ab）2为双体，可与2个抗原分子结合。抗体存在于免疫动物的血清或体液中。
植物病毒的抗血清，是将病毒的提纯液作为抗原，一般以家兔，有时也以小鼠或母鸡等为免疫动物，通过静脉、肌肉或腹腔等途径，逐渐增加剂量，多次注射抗原。待抗体产生后，采血，取出其血清即为该病毒的抗血清。免疫家兔产生的抗血清称为兔抗体；免疫小鼠产生含特异抗体的腹水，采收的腹水，内含“腹水抗体”；免疫母鸡，产生含抗体的鸡蛋，从蛋黄中提取的抗体称为“蛋黄抗体”。运用细胞融合技术，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞杂交，产生杂交瘤细胞，其增殖能力很强，可在体外连续培养产生抗体。选择其中能产生某单一抗体的细胞株，所产抗体称“单克隆抗体”。单克隆抗体开创了在动物体外产生抗体的新时代。
这里介绍几种常用的血清学检测技术。
1 免疫双扩散法
又称奥氏琼脂双扩散法。琼脂在水中加热溶解，冷却时成为凝胶平板，在上打数孔，分别放入抗原和抗体，它们各自向凝胶中扩散，于抗原和抗体比例最适的位置上形成沉淀反应。
具体步骤：按每1～2g（一般用1.2g）琼脂粉，于100ml生理盐水中，置沸水浴或家用高压锅中溶化，配成1%～2%琼脂，加0.1%叠氮化钠，防腐，用吸管或其他物品，将琼脂均匀地铺于洁净的玻璃平板（可用载玻片或裁制成的大小一致的玻板）上，以热的琼脂液刚铺满为限，约1.5～2mm厚，静止待凝固，制成的琼脂板置保湿器皿中待用。检测时，琼脂板下放一“孔排列图”，用打孔器按图样打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中间1孔，四周6孔；方阵形，有5孔，即中间1孔，四周4孔（图1）。打出孔后，用针或吸器将孔中凝胶圆片取出，在孔中加适宜稀释度的抗原或抗体，抗原孔中应包括已知阳性抗原、待测抗原和健株对照，可以用病健株的汁液或提纯病毒液。加满各孔，持平放于保湿器中数小时或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射灯光上方观察沉淀线。抗原和抗体的适宜浓度是影响反应结果的主要因素，因此必须注意：第一，孔径和孔距（相邻两孔边的最短距离）要适宜，两者之比以2∶1为宜，即孔距等于孔的半径，孔距过大，沉淀线便不能出现或变模糊，并且反应时间拉长，不能很快见到结果；第二，掌握反应物的最适浓度，为此，对所用抗体或抗原，分别作倍比稀释，先测知两者反应的最适浓度后，再进行正式反应。
图1 打孔图样
免疫双扩散实验可以用于鉴定抗原与抗体是否具有特异性和确定两个抗原是否相同。在抗原与抗体之间出现沉淀线说明抗原与抗体为特异相关。见图2。
图2 抗原与抗体之间出现的沉淀反应
如TMV抗血清与某一未知感病材料汁液发生沉淀反应，说明此感病材料含有TMV。
比较两个抗原是否相同，有三种情况（图3）：①抗原相同：甲抗原与甲抗体形成特异沉淀线，而相邻的乙抗原也形成沉淀线，两条线连成一条，说明甲乙两抗原相同。②抗原部分相同：甲和乙抗原虽均产生沉淀线，两线成分枝状连结，说明乙抗原的沉淀线只与甲抗原相连，表明两抗原仅有部分相同。③抗原不同：甲乙两抗原的沉淀线呈交叉状，说明两者抗原性完全不同。
图3 抗原与抗体之间出现的沉淀反应用于比较两个抗原
免疫双扩散实验已广泛用于植物病毒的鉴定、检测、研究病毒间的亲缘关系和测定抗体的效价等。具有操作简单、省时、省样和鉴别能力强等优点，特别适用于球状和直杆状病毒。长线状病毒，易凝集，难以在琼脂中扩散，必须在反应前加SDS降解病毒粒体后，才能获得较好结果。
2 免疫电泳
免疫电泳是将免疫扩散和电泳结合在一起的一项实验技术。可以把组分复杂的抗原，通过电荷和泳动的不同而分开，从而增加了鉴别能力。常用的方法有对流免疫电泳和平板电泳。
对流免疫电泳是抗原和抗体相对排列（图4），置于一定电场中，以碱性缓冲液为电解质时，抗原所带负电荷多于抗体，因而抗原向正极移动；而抗体虽也有微弱的向正极移动的力量，但处于较强的电渗作用下，它反而略向负极移动。两者在电场作用下约泳动15min便可在两者之间出现沉淀线。对流免疫电泳比琼脂双扩散的反应快，适用于大量样品的快速检测。
具体步骤：用0.025mol/L硼酸缓冲液（pH8.6）或0.05mol/L TrisM缓冲液（含EDTA）配制1%～1.2%琼脂，铺板，排列抗原和抗体。抗原和抗体孔的孔距同孔的直径，抗原和抗原（抗体和抗体）的孔距等于孔的半径。测定中，必须设已知阳性抗原液为阳性和健康原液为阴性对照。琼脂板放电泳槽，槽中加入上述缓冲液，用滤纸使板的两端与槽中缓冲液相连。10～12V/cm，电泳20～30min，观察结果。
平板免疫电泳是在一块琼脂平板上，先电泳抗原，使其不同组分分开，再进行免疫双扩散反应。具体步骤：在琼脂板上打出抗原孔，放入待测抗原、阳性和健康对照。10～12V/cm电泳1～2h，取出，按图5在两抗原孔之间挖一条宽约2mm的槽，孔槽间的距离与孔直径相同。槽中放满抗血清。平放于保湿器皿中，过夜，观察结果。
图5 平板免疫电泳抗原和抗体排列图
3 酶联免疫吸附测定法
（ELISA）
酶联免疫吸附测定法简称“酶联”。它的灵敏度高，可以检出微量的抗原，适于检测大量样品，可以定性和定量分析。其原理是标有酶的抗体（或抗原）与其抗原（或抗体）结合，则酶作用于底物产生颜色，以颜色有无及深浅，来判断抗体和抗原是否有反应，以及浓度大小。酶联免疫吸附测定法在应用中派生出多种不同的方法。
应用酶联检测前，先要做好提取纯免疫球蛋白（IgG）、制备酶标抗体和配制底物等准备工作。
3.1 提取γ-球蛋白和分离IgG
介绍硫酸铵沉淀法，步骤如下：
抗血清，加等体积生理盐水，摇匀，加等体积饱和硫酸铵液（逐滴加，边加边搅），于4℃静置1h，于低温下，4000r/min，离心30min。留沉淀，加少量生理盐水溶解沉淀，装透析袋于4℃冰箱，用0.01mol/L PBS（pH7.5）透析换水多次，至测试无NH4+和SO42-，低温下，4000r/min离心15min。弃沉淀，获得γ-球蛋白。
分离IgG，用DEAE-纤维素柱层析法，步骤为：
DEAE-纤维素（6～8g）放于烧杯中，加蒸馏水搅拌，静置30～45min，1mol/L NaOH洗涤—蒸馏水洗涤—1mol/L HC1洗涤—蒸馏水洗涤—1mol/L NaOH洗涤—蒸馏水洗涤—PBS液洗涤多次，至pH达7.0～7.5为止。净化后DEAE-纤维素装柱（柱长30cm，直径1～2cm），加蒸馏水洗柱，再用0.01mol/LPBS（pH7.2）洗柱，使pH达7.2为止。保持柱面平，吸出多余的PBS，只留下2mm深的液面，加γ-球蛋白液，打开层析柱下端的开关，待液进入柱内，当液面距离柱面2mm深时，加1ml 0.1mol/L PBS（pH7.5），重复1次，待缓冲液尚未流入柱中时，柱上端接马氏瓶，洗脱，调整流速达10～15滴/min。分管收集洗脱液，用10%磺基水杨酸测定每管中是否含有IgG。将含有IgG的各管液合并，测定IgG浓度，冷藏备用。
3.2 制备酶标记抗体
制备酶标记抗体是将酶和IgG结合成稳定的酶标抗体结合物。制备时宜选择分子量小、活性强、纯度高和价格便宜的酶，较常用的有辣根过氧化物酶（简称HRP）和碱性磷酸酶。
酶标抗体活性的保持期限视浓度和贮藏方式而异。稀释液（1∶10）的保存时间短，一般在12h内使用完毕；浓溶液在低温下可保持活性1个月，故可贮藏使用数周；浓溶液冻干保存，可无限期保持活性。酶标记抗体可以是特异性的某种病毒的酶标记抗体，也可以是羊抗兔酶标抗体。目前试剂公司有酶标抗体出售。
3.3 双抗体夹心法酶联技术
双抗体夹心法由于检测灵敏度高，检测结果准确，在病毒检测上应用非常普遍。
实验步骤如下：
（1）包被特异性抗体IgG 用包被缓冲液（0.1mol/L碳酸钠缓冲液，PH9.5）稀释IgG为1～10g/ml，在酶联反应板每孔中加入200μl，于37℃孵育2h，4℃过夜，使IgG包被在孔的表面。
（2）洗涤 用洗涤液（0.02mol/L PBS pH7.2，内含0.5%吐温—20，0.1%牛清白蛋白），洗去包被后多余的IgG，洗3次。
（3）加待测抗原，同时设已知阳性、阴性和空白对照 由于反应板边行各孔有边际效应，结果不稳定，所以边行一般设为空白对照，37℃孵育2h。
（4）洗涤 同（2）。
（5）加酶标抗体IgG 可以是特异性抗体或羊抗兔酶标抗体，37℃孵育2h。
（6）洗涤 同（2）。
（7）加底物，于37℃孵育1h。
（8）加终止液 每孔加入3mol/L NaOH或2mol/L H2SO4 50μl，终止反应。
（9）读取检测结果 于酶联检测仪中测反应液的光密度，所用波长视底物而异。邻苯二胺底物，于492nm波长下测定；联大茴香胺在405nm波长下测定。凡光密度比阴性对照的数值≥2倍时，判断为阳性。无分光光度计时，可以用肉眼判断，与空白和阴性对照比较，呈黄色的为阳性，颜色越深，阳性越强，可以用+、++或+++表示。空白和阴性无黄色，表示此实验结果可信。
3.4 间接法酶联技术
本法采用特异性抗体，和羊抗兔（或羊抗鼠）酶标物，进行酶联反应，省去了制备酶标抗体的繁琐工作，因而较为简化而经济。其步骤简介如下：
3.5 直接法酶联技术
用特异性酶标抗体检测抗原的方法。其步骤简介如下：
虽然生活经常设置难关给我们，但是让人生不都是这样嘛？一级级的打怪升级，你现在所面临的就是你要打的怪兽，等你打赢，你就升级了。所以遇到问题不要气馁。如需了解更多血清学诊断的方法的信息，欢迎点击探索吧其他内容。
